璧山蔡司显微镜和艾克发生物将联合提供解决方案

　　近些年，肿瘤免疫微环境(TiME)成为肿瘤研究领域的一个热门的话题，也吸引了大批研究人员的注意力。一篇又一篇文献在期刊上不断发表，人类对于肿瘤发生、发展、转移、复发等的认识也不断加深。在众多相关文献中，我们经常可以看到一张张绚丽的多重免疫组化(mIHC)的图像。

　　为什么这么多研究人员都选择mIHC技术呢?主要是因为肿瘤免疫微环境的复杂性和多样性，为了更好的了解不同类型细胞的分布和相互关系，需要同时对多种生物标志物进行标记。

　　但是在实际实验中，mIHC 却让人很头疼。如何选择抗体、如何进行标记、如何进行染料搭配等等问题让实验变得耗时耗力，结果还往往不理想。

　　如何将 mIHC 从科研的拦路虎变成高分文献的助推器?这需要技术层面提供更全面的解决方案和数据分析能力。下面我们会以非小细胞肺癌样本的染色为例，为大家展示如何利用该技术进行肿瘤免疫微环境的研究。

　　我们将非小细胞肺癌样本的11个常见肿瘤免疫相关生物标志物进行了染色标记和全切片成像。

　　(photo by ZEISS Axioscan7, 该设备可对肿瘤免疫微环境研究中的多色荧光标记切片进行更高效率、更高质量的成像。)

　　11-plex的多靶点免疫组化结果可获取211种表型信息，根据不同的实验设计和研究方向如免疫细胞分型、三级淋巴结构、肿瘤相关巨噬细胞等，可以组成不同Panel组合分别进行分析。下面是一些常见的研究方向对应的组合信息。

　　免疫细胞分型研究

　　免疫细胞分型研究包括了CD3，CD4，CD8，CD45RO，PANCK，共计5个生物标记物(见图3)。PANCK(绿色)标记肿瘤细胞，其余可精准分型T细胞(CD3+)、辅助T细胞(CD3+CD4+)、细胞毒性T细胞(CD3+CD8+)、记忆辅助T细胞(CD3+CD4+CD45RO+)和记忆细胞毒性T细胞(CD3+CD8+CD45RO+)。

　　三级淋巴结构研究

　　三级淋巴结构(TLSs)是存在于肿瘤或很多炎症部位周围的异位淋巴结构，其结构和功能与次级淋巴器官相似，是TiME中抗肿瘤免疫应答启动的直接部位，对患者的生存预后、治疗反应及免疫治疗应答评估都有积极的作用。TLSs的组成一般包括B细胞、T细胞、滤泡树突状细胞、浆细胞、成纤维网状细胞、中性粒细胞、肿瘤相关巨噬细胞等[1]。

　　三级淋巴结构研究包括了CD3，CD20，KI67，PANCK，共计4个生物标记物(见图4)。PANCK(绿色)标记肿瘤细胞，其余可精准分型T细胞(CD3+)和B细胞(CD20+)，KI67可观察各细胞的增殖情况。

　　对CD3+细胞进行热图分析，结果见图5，图中红色是CD3+细胞表达丰度高的区域，黄色到绿色是表达丰度下降的区域。

　　对结果进行空间近邻分析，以PANCK为中心，可得到CD3+细胞与PANCK+细胞的平均距离为37.40 μm(结果见图6)。

　　肿瘤浸润淋巴细胞研究

　　肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)研究包括了CD3，TIM3，PD-L1，CD68，PANCK，共计5个生物标记物(见图7)。PANCK(绿色)标记肿瘤细胞;分别统计肿瘤和间质区域内的CD8+细胞(红色)的百分比，确认浸润程度;TIM3标记肿瘤浸润CD8+T细胞功能失调的亚群，可作为实体瘤的预后标志物;PD-L1表达情况确认是否采用该靶点进行免疫治疗;同时可对巨噬细胞(CD68+)和肿瘤相关巨噬细胞(CD68+PD-L1+)进行数量、密度和百分比的统计分析。

　　进行浸润分析(见图8)，划分肿瘤和间质边界(图中黄线)，以100 μm的阈值分别向肿瘤中心和间质区域进行浸润分析，统计不同浸润区域内CD8+细胞的数量、密度和百分比(见表1)。

　　肿瘤相关巨噬细胞研究

　　巨噬细胞研究包括了CD68，CD163，PD-L1，PANCK，共计4个生物标记物(见图9)。PANCK(绿色)标记肿瘤细胞;CD68标记M1型巨噬细胞，CD163标记M2型巨噬细胞;PD-L1+CD163+标记肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)。

　　上面是我们列举的12色多重免疫组化染色中的部分研究Panel。除此以外，还可以根据不同的实验需求组成更多不同的组合。看完上面的实际案例，您是否也有兴趣设计自己的染色方案，窥探肿瘤免疫微环境奥秘?璧山蔡司显微镜和艾克发生物将联合为您提供从染色标记到扫描成像，再到数据分析的整套解决方案。